Bakteriers vækst

Teori:

Når bakterier vokser, bliver de ikke større og større, men deler sig til to nye celler, som er komplette kopier af den oprindelige celle. De to nye celler kan igen dele sig og danne 4 nye celler, som igen kan blive til 8 celler, og så videre. Generationstiden er den tid som bakterien er om at dele sig.

Der er mange årsager til, at det er væsentligt at kende bakteriernes generationstid. Det er således vigtigt at vide, hvor hurtigt sygdomsfremkaldende bakterier som f.eks. Salmonella-bakterier vokser, da man herved kan beregne, hvor hurtigt bakterierne kan sprede sig og inficere nye personer. Det kan også være vigtigt at kende bakteriers vækst, hvis man arbejder i naturmiljøer. Nogle bakterier i naturen kan nedbryde og hermed fjerne giftige pesticider. Hvis man kendes disse bakteriers vækst, kan man beregne hvor lang tid bakterierne vil være om at nedbryde pesticiderne.

Materialer:

·         Spektrofotomer

·         kuvette

·         Bakteriekultur

·         4 Eppendorf rør

·         2 blodagarplader

·         0,9 % NaCl

·         Automat pipette

Vækst af bakterier

Det praktiske arbejde indebærer:

·         Måle turbiditet i bakterieprøver med et spektrofotometer.

·         Lave fortyndinger af bakteriekultur

·         Udsåning af bakteriefortyndinger ud på agarplader.

·         Tælle kolonier på agarplader efter inkubation af bakterierne (som er lavet på forhånd).

Fremgangsmåde:

Måling af turbiditet.

1.      Indstil spektrofotometret på bølgelængden 600 nm. I menuen vælges ”fixed”. Under bølgelængde indstilles apparatet til 600 nm.

2.      Klargør 2 målecuvetter med 1,5ml Milli Q vand i hver.

3.      Spektrofotometret nulstilles ved brug af vand i referencecuvetten og målecuvetten, tryk ”zero base”.

4.      Indsæt blindprøve bestående af medie uden bakterier. Mål absorbansen og noter resultatet.

5.      Overfør 1ml af kulturen til en målecuvette og mål turbiditet (absorbansen). Noter resultatet af målingen.

6.      Dette gøres for alle prøver fra de forskellige tidsintervaller.

Fortynding og Udsåning af bakterier på blodagarplader

1.      Der udleveres en bakterieopløsning der har stået i et af tidsintervallerne (1 -6 timer)

2.      Skrive nr. 1-4 på fire Eppendorf rør. 

3.      Tilsæt 0,9 % NaCl opløsning til de fire Eppendorf rør, som vist på figuren.

4.      Til rør 1 tilsættes 100µl bakteriekultur i 900µl 0,9 % NaCl opløsning, bland prøven grundigt med pipetten tre gange. Prøven er nu fortyndet 10 gange.

5.      Fra den 10 gange fortyndede prøve overføres 10 µl til 990µl 0,9 % NaCl opløsning. Prøven er nu fortyndet 1000 gange.

6.      Fortsæt efter samme mønster med de to restende fortyndinger.

7.      Med en 10 µl øjepodenål totalspredes bakteriekultur fra rør 3 og 4 på hver sin agarplade.

Totalspredning:

De 10 µl fra øjepodenålen sættes på midten af pladen og totalspredes med en hockey stav, som illustreret af underviser.

8.      Færdig inkuberede plader aflæses og antallet af kolonier tælles. Noter resultat.

Resultatbehandling til øvelsen ”Bakterievækst”.
Optælling af antallet af kolonier (CFU) af E.coli på petriskålene fra 30, 60,90,120,150,180 og 210 minutter.

Udregnet generationstid (dvs. tiden der går før antallet er fordoblet)
Generationstiden for absorbansen er 33,977 minutter, hvilket betyder at der går 33,977 minutter før absorbansen er fordoblet.

Generationstiden for antallet af CFU pr. mL er 28,4078 minutter, hvilket betyder at der går 28,4078 minutter før antallet af CFU pr. mL er fordoblet.

Grafen for væksthastigheden N’(t) som funktion af tiden, t

Diskussion til øvelsen ”Bakterievækst”

·        Overvejelse af om bakterierne bliver ved med at vokse eksponentielt, og diskussion af modellens rækkevidde.
I den virkelige verden vil bakterierne vokse eksponentielt ind til, at de når en stationær fase. I den stationære fase, vil bakterierne dø ligeså hurtigt, som der vil vokse nye bakterier frem.  Efter et bestemt tidspunkt, som kommer an på, hvilken bakterie der er tale om, vil bakterierne nå dødsfasen, hvor der dør flere end der kommer nye. Dette er illustreret ved nedenstående billede. Det er altså logistisk vækst, hvor det starter med eksponentiel vækst og flader ud mod en asymptote.
  

Faktorer i omgivelserne som påvirker bakterievæksten
De fleste bakterier vokser bedst omkring 37^∘C, derudover har de fleste bakterier det bedst i et neutralt miljø dvs. en pH-værdi på 6-8. Bakterierne har også brug for næring for at kunne formere sig. Så temperaturen, pH-værdi og mængde af næring spiller en stor rolle for bakteriernes vækstmulighed.

Fejlkilder ved de anvendte metoder.
Der kan være en masse fejlkilder ved dette forsøg. En af fejlkilderne kan være, at man fik fortyndet blandingen forkert, ved at komme til at indstille pipetten forkert. På den måde ville man enten få for mange eller for få bakterier i blandingen og dermed få en forkert fortynding. En anden fejlkilde kan være, hvis man ikke får blandet koncentrationen af bakterier og det demineraliserede vand godt nok, og de fleste af bakterierne kommer til at ligge på bunden. Det kommer til at påvirke resten af fortyndingerne. Derudover kan der forekomme fejl ved brug af nåleøje og hockeystav, hvis man ikke er rutineret bioanalytiker. Fejlkilderne ved brug af nåleøjet kan være: at man får nok væske i nåleøjet, ikke kommer af med hele væsken eller får stukket nåleøjet ned i agar pladen. Når man benytter hockeystaven, kan det ske at man ikke får spredt væsken godt nok ud eller kommer til at trykke for hårdt og dermed ødelægge agar pladen. Det kan også hænde, at der kommer andre bakterier ned i agar pladen og forstyrrer væksten. Til sidst kan der fremkomme fejl ved tælling af kolonier, da det kan være svært at tælle præcist, hvis der er rigtig mange.